Giulio de Medici, a Rend Lovagja és Capua Nagypriorja, akit VII. Kelemen néven pápává választottak, kérésével V. Károly német-római császárhoz, Spanyolország királyához folyamodott. Az uralkodó 1530. július 24-én Castelfranco di Emilia-ban a Lovagrendnek adományozta a Máltai szigeteket és az észak-afrikai parton lévő Tripolit, nemes és szabad feudum örökös jogával felruházva, s az ajándékozás aktusát pápai bulla erősített meg.
A Rend örökös kötelessége volt, hogy Spanyolország királyának és utódainak, - a Szicíliai királyoknak – jelképes tiszteletére minden évben, Mindenszentek napján egy sólymot ajándékozzanak. Ettől kezdve a Jeruzsálemi Keresztelő Szent János Rend Lovagjait Máltai Lovagoknak nevezték és Máltát a szigeteivel pedig önálló lovagi államként ismerték el a világon.
Ezt követően Málta szigete, amely eddig szinte teljesen lakatlan és üres volt, a kereszténység védőbástyájává vált. A keresztesek gyors mozgású haditengerészete állandó harckészültségben volt, folyamatosan ellenőrzése alatt tartotta a tengert és vigyázott Szicília és Itália védtelen partjaira, pótolva ezátal a királyi flotta katonai hiányosságait és lassú reagálását. Időközben a törökök elfoglalták Budát, és komolyan fenyegették a szomszédságukban lévő Bécs városát.
1534-ben meghalt Phillipe de Villiers de l'Ile Adam Nagymester. Mindenki megsiratta a Lovagrend nagyszerű és rendíthetetlen vezetőjét és parancsnokát. Nagy Szulejmán szultán személyesen rendelte el, hogy megemlékezésként, minden mecsetben olvassák fel a régi ellenfél dicső tetteit. Mindamellett elhatározta, hogy megsemmisíti a Lovagrendet és 1551 nyarán Málta ostromára indult. Azonban a török hajók mindhiába cirkáltak a sziget körül, nem merték megkockáztatni a támadást, mivel a Lovagok olyan erős flottát hoztak létre, amellyel nemcsak Máltát védték, hanem az egész Földközi-tenger felett őrködtek.
1565. május 18. napján kezdődött az a szörnyű esemény a Lovagok életében, Jean Parisot de la Vallette, a Rend 48. - a Dél-Franciaországi Provence-ból származó - Nagymesterének parancsnoksága alatt, amely a Nagy Ostrom néven került be a történelembe. A 200 hajóból és 50.000 muzulmán harcosból álló flotta Allah nevében támadást indított Málta ellen. A Lovagok mindössze 9000 katonával majdnem négy hónapon át sikeresen ellenálltak és több mint 20.000 ellenséges támadót öltek meg. La Vallette Nagymester hetvenéves kora ellenére az első vonalban harcolt. Amikor II. Szulejmán szultán megtudta, hogy II. Fülöp spanyol király katonai erősítést küldött Máltára, Toledoi Don Garcia, Szicília alkirálya parancsnoksága alatt, a szultán dührohamot kapott és 72 éves korában meghalt. 1565. szeptember 7-én a törökök beszüntették a sziget ostromát. A Lovagok revansot vettek a Rodoszon elszenvedett vereségért: a törökök elveszítették tengeri uralmukat a Földközi-tengeren és Málta két évszázadon át megőrizte sérthetetlenségét. A győzelem nagy visszhangot keltett Európában és a Lovagrendnek volt a legerősebb hadiflottája a Földközi-tengeren. (A Nagy Ostromról szól Tim Willock „ A Lovagrend ” című izgalmas történelmi regénye.)
A spanyol király armadájával közösen a Rend három dicsőséges hadi cselekményben vett részt: 1541-ben Algír meghódításában; 1551-ben Zoara megtámadásában; valamint 1559-60-ban a Tripoli expedícióban és Djerba szigetének elfoglalásában. 1571. május 24-én V. Pius pápa ösztönzésére Spanyolország és Velence részvételével megalakult a Szent Liga. V. Károly császár és spanyol király fia, Ausztriai Don Juan által vezetett tengeri flottához csatlakozott a Rend néhány óriásgályája, (galleonja). Ugyanezen év szeptember 16-án a Szent Liga flottája vitorlát bontott.
1571. október 7-én megkezdődött a lepantói csata, amelyben a Lovagok kiemelkedő szerepet játszottak és nagyban hozzájárultak a hatalmas győzelem kivívásához. Meghalt 60 Lovag és majdnem minden túlélő megsebesült, de megszereztek 160 gályát, 80-at pedig felgyújtottak és az ellenség több mint 30.000 harcosát a tenger fenekére küldték. A lepantói csatában elszenvedett vereséggel kezdődött a félhold alkonya, amelynek csúcspontját a haditengerészetének hanyatlása jelentette.
A katonai kötelezettségek azonban soha nem halványították el a Lovagok alapvető kötelességét: a könyörületességet és elhivatottságot az emberek gyógyítására. Máltán létesített kórházuk egyedülálló volt a világon: a termekben márvány padló, a falakon kárpit, az asztalokon ezüst eszközök, a finom lenvászon ágyneművel vetett ágyak olyan luxust jelentettek, amely akkoriban egyetlen más helyen sem létezett a világon. S orvosi, anatómiai és sebészi ismereteket oktató iskolákat hoztak létre. A pápa és Franciaország, Spanyolország valamint Portugália királyának segítségével a Lovagok palotákat, templomokat építettek és a gyönyörű francia Szent János katedrálist is. A Nagymesteri palotában a mai napig látható a különleges fegyvergyűjtemény és XIV. Lajos, a Napkirály nagylelkű ajándéka, a tíz káprázatos gobelin – falikárpit, amelyek a „Nagy Kelet-India” témáját örökítették meg.
A francia forradalom viharként söpört végig Európán. 1792-ben elkobozták az Ispotályos Lovagrend minden franciaországi vagyonát, majd ezt követően ugyanerre a sorsra jutottak az itáliai lovagrendi birtokok is. A forradalom megszüntette a Lovagrendeket. 1798. június 7-én a francia armada egyiptomi expedíciójának első fregattjai befutottak Málta alá. Június 9-én Bonaparte Napoleon tábornok és nagy létszámú serege is megérkezett. Június 12-én reggel Napoleon kikötött és partra szállt La Valletta városában.
A döntésképtelen Nagymester, a német Ferdinand von Hompesch zu Bolheim gyenge személye és az elkövetett súlyos stratégiai hibák miatt Napoleon harc nélkül megkaparintotta a Lovagok dicsőségének és vérének örökségét, cserébe egy – soha be nem tartott – ígéretért: amely szerint a Lovagok Franciaországban a rangjuknak megfelelő fogadtatásban részesülnek.
Málta, amely századokig ellenállt a törököknek és a kalózoknak, kinyitotta kapuit az ellenség előtt. A napoleoni katonák, - a forradalom gyermekeihez „méltóan” - folyamatosan raboltak és fosztogattak mindenütt és mindent, amit csak tudtak.
Június 19-én Napoleon elindult Egyiptomba a francia armadával, hátrahagyva 1000 katonáját, Claude Vaubois tábornok parancsnoksága alatt, a sziget védelmére.
A máltaiak angol csapatok segítségével harcoltak a franciák ellen, akik megadták magukat és feladták a szigetet. 1800. szeptember 5-én már brit lobogó lengett Málta felett.
Málta elvesztése a Rend végét jelenthette volna. A Rend azonban, mint a mítikus főnixmadár, saját hamvaiból született újjá, nem halt meg és soha nem is fog meghalni.
Miközben elfoglalták a Lovagrend államának területét és birtokait bárki büntetlenül, nyíltan eltulajdoníthatta, - cinikus módon - a hat európai nagyhatalom 1802. március 27-én aláírta az Amiens-i Szerződést. Ez a nemzetközi békeegyezmény elismerte és biztosította a Jeruzsálemi Szent János Rend független újjáalakítását, védelmét, fennmaradását és szuverenitását.
A Lovagrend 1308-ban Rodoszon elnyert szuverenitása, amelyet az Amiens-i Szerződés is elismert, soha nem szűnt meg létezni, területtel vagy terület nélkül egyaránt. A Nemzetközi Jog alapelve értelmében az egyszer átruházott jog nem kívánja meg a jog fenntartásához azon hatalom folyamatos fennállását, amely által elnyerte ezt a jogot. Ha egy szerződés, vagy bármely egyéb törvény egyszer alkalmazásra került egy bizonyos jog elismerésére, akkor a szerződés, vagy a törvény megszűnése nem vethet véget az adott jog érvényességének.
